Тест на коронавірус на основі CRISPR/Cas видасть результат за п’ять хвилинОпубліковано


Новий тест на SARS-CoV-2 на основі системи CRISPR/Cas обіцяє достовірний результат вже за п’ять хвилин. При цьому він визначає навіть десятки копій вірусної РНК в мікролітр зразка і дає не тільки кількісну, але і якісну відповідь. Щоб домогтися такого результату, вчені використовували комплект з декількох напрямних РНК замість однієї, а в якості детектора сигналу пристосували камеру смартфона. Результати роботи попередньо опубліковані на порталі нерецензірованних манускриптів medRxiv.

Незважаючи на те, що перші тести на SARS-CoV-2 з’явилися в лічені тижні після початку епідемії, вчасно виявити заражених людей до сих пір складно. Проблема в тому, що тести повинні бути масовими і швидкими, оскільки частина людей, які можуть бути заразні, не мають симптомів або розвинуть їх тільки через кілька днів, а концентрація вірусу в їхній слині часто вже не відрізняється від такої у хворих COVID-19.

Найпоширеніший спосіб зловити вірус в мазку мокротиння – ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція) в реальному часі. Принцип її роботи полягає в тому, що набір ферментів копіює кожну молекулу вірусної РНК і позначає її флуоресцентним барвником – і так відбувається до тих пір, поки світловий сигнал не стане достатньо сильним, щоб його розпізнав прилад.

Метод ПЛР популярний в основному за рахунок своєї чутливості – він дозволяє «побачити» одну-єдину копію РНК в мікролітрі зразка. Але у нього є свої недоліки: тест займає від кількох десятків хвилин до декількох годин, що з урахуванням логістичних труднощів перетворюється щонайменше на добу очікування результату, за які безсимптомний носій встигає поширити інфекцію далі.

Тому виник запит на більш швидкі тести, які не обов’язково повинні бути настільки чутливими: за даними клінічних досліджень, при концентрації РНК нижче тисячі копій на мікролітр кількість вірусних частинок в мазку вже не настільки істотно і не представляє великої небезпеки. Одним з альтернативних методів, який міг би дозволити прискорити тестування, стала система CRISPR/Cas (та сама, за яку недавно присудили Нобелівську премію з хімії).

Для пошуку SARS-CoV-2 цю систему пристосували ще навесні, і працювало це приблизно так: з мазка пацієнта швидко екстрагують РНК і кілька разів копіюють цілком. Потім додають направляючу РНК, комплементарних до послідовностей вірусу. Ця РНК зв’язується з вірусним геномом і активує фермент групи Cas, який починає різати вірусну РНК – а заодно і все молекули одноцепочечной РНК, з якими зустрічається. Якщо додати в розчин молекулу РНК, пов’язану з барвником, то при розщепленні він буде вивільнятися і подавати колірний сигнал про те, що вірус в пробі виявлено.

Вся ця процедура займала близько години – що вже швидше, ніж ПЛР в реальному часі, але ще недостатньо швидко для масових тестувань, а головне – вимагає складного обладнання та реагентів. Тому група вчених з Каліфорнійського університету під керівництвом нобелівського лауреата Дженніфер Дудна (Jennifer Doudna) зайнялася розробкою ще більш швидкого і просто тесту на SARS-CoV-2.

Дослідники створили десяток напрямних РНК (всі вони були комплементарні до різних ділянок вірусного генома) і відібрали з них найбільш ефективно працюючу пару. Система, в якій напрямних РНК стало дві, дозволила відразу вирішити декілька проблем.

Принцип роботи тесту на основі CRISPR / Cas з двома направляючими РНК

По-перше, кожна копія вірусної РНК запускає роботу не одного ферменту Cas13а, а відразу декількох. А це, в свою чергу, дозволяє обійтися без попереднього копіювання всієї РНК в зразку – сигнал і так виявляється досить сильним. У повній версії новий тест займає півгодини, але вже за першими п’яти хвилинах спостереження вченим вдалося однозначно визначити, які зразки позитивні, а які негативні.

По-друге, тепер тест-система працює ще точніше і не реагує на РНК інших вірусів: дослідники перевірили її на кількох споріднених SARS-CoV-2 коронавірус (в тому числі MERS) і не отримали сигналу. Чутливість при цьому залишилася прийнятною – близько сотні вірусних РНК на мікролітр. Коли ж вчені спробували додати в систему третю направляючу РНК, то чутливість виявилася ще вище – до 31 копії на мікролітр.

По-третє, тепер тест дозволяє оцінити не тільки наявність, але і кількість вірусної РНК. Оскільки з методу зник етап копіювання РНК, то число копій РНК в зразку не змінюється, і про нього можна судити по інтенсивності сигналу. Дослідники вважають, що така технологія могла б допомогти відстежувати розвиток хвороби у окремих пацієнтів.

Нарешті, в якості детектора вчені використовували камеру смартфона, на основі якої сконструювали лазерний флуоресцентний мікроскоп, додавши джерело лазерного променя і фільтр. Виявилося, що чутливості камери досить, щоб обійтися без громіздких приладів і розрізняти сигнали різної інтенсивності з зразка.

Принцип роботи мікроскопа на основі смартфону

Нова система поки працює тільки в лабораторних умовах, проте Дженніфер Дудна розповіла журналу Science, що її колеги шукають спосіб вийти зі своїм винаходом на ринок. Вони вважають, що їх метод ще довгий час залишатиметься актуальним: навіть якщо вакцина від коронавірусу з’явиться в найближчі місяці, поки немає ніякої гарантії, що викликаний їй імунну відповідь виявиться довгостроковим – а значить, залишиться потреба в масовому тестуванні, щоб відстежувати локальні спалахи інфекції .

Джерело: N+1

наукановини

Залишити відповідь

Ваша e-mail адреса не оприлюднюватиметься. Обов’язкові поля позначені *